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El ámbar y la genética del ADN

El ámbar y la genética del ADN

Texto: Analía A. Lanteri y Viviana A. Confalonieri

El ADN en el ámbar. La posibilidad de conocer el genoma de numerosas especies o poblaciones extinguidas ayuda a reflexionar sobre los procesos que dieron origen a la diversidad y la evolución de la vida en la Tierra. 

Desde que J. Watson y F. Crick propusieron en 1953 un modelo de la estructura del ácido desoxirribonucleico (ADN) que coincidía con las evidencias experimentales, los científicos hemos aceptado que esta molécula, presente en todos los seres vivos, es la depositaria de la información genética. Dicha información, transmitida de generación en generación, se registra como un código, el cual está determinado por el orden –o secuencia– de las bases nitrogenadas –la adenina, la timina, la citosina y la guanina– que forman parte esencial del ADN. El conjunto de las bases, y su ordenamiento, es lo que constituye el denominado genoma del organismo en estudio.

Los avances logrados en biología molecular y en el estudio del ADN en especial, desde el momento en que se comprendió su estructura, son asombrosos. Probablemente solo sean comparables a los cambios que se produjeron en el campo de la física teórica durante la primera mitad del siglo XX, cuando Albert Einstein expuso su teoría de la relatividad general y provocó un cambio en la manera de interpretar los fenómenos físicos. De la misma forma, los adelantos en biología molecular en las últimas décadas del siglo XX parecen haber derribado las limitaciones que impone el tiempo cronológico a los seres vivos. Por un lado nos han permitido proyectarnos hacia el futuro, ya que por medio de los procedimientos de clonación es posible perpetuar en el tiempo linajes que poseen las mismas características genéticas que sus progenitores; y por otra parte nos permiten regresar al pasado, mediante la reconstrucción de genomas de grupos de organismos extinguidos hace millones de años.

Los estudios del ADN nos ofrecen una nueva perspectiva de la realidad del mundo orgánico, abriéndonos paso a la lectura del texto más íntimo en la construcción de la vida. Sin embargo, por momentos, estos mismos estudios parecen alejarnos del mundo real y conducirnos al terreno de la ciencia-ficción, estimulando la imaginación de los especialistas y legos más audaces y entusiastas. 


Preservación del ADN ‘antiguo’ 

El ADN presente en las células de organismos muertos desde mucho tiempo atrás se encuentra degradado, ya que inmediatamente después del deceso se inician procesos de autólisis –en los que están implicadas enzimas propias del organismo– que provocan la descomposición de las sustancias orgánicas de los tejidos blandos. En una etapa posterior actúan otros agentes deteriorantes, tales como bacterias, hongos e insectos. El proceso de destrucción de los tejidos blandos puede ser lento, o incluso detenerse, dependiendo de ciertos factores ambientales o tratamientos artificiales, que contribuyen a su preservación.

Según la forma en que han sido preservados, los restos orgánicos se clasifican en secos, húmedos, encriptados o congelados. A la primera clase corresponden, por ejemplo, las momias indígenas de América del Sur. El clima seco y caluroso provoca una rápida pérdida de humedad en los cuerpos, lo cual detiene los procesos de autólisis y conduce a un estado de preservación denominado momificación natural. Los ejemplares de herbarios, huesos y plumas de aves encontrados en los museos, así como semillas ‘arqueológicas’, constituyen otros ejemplos de este tipo particular de preservación. Por otra parte, la misma humedad puede ayudar a la conservación de tejidos de origen animal o vegetal, siempre y cuando se generen condiciones anaeróbicas –o sea ausencia de oxígeno–, como en el sitio de Windover, Florida, Estados Unidos, donde se encontraron restos humanos enterrados en turba de los cuales se pudo extraer ADN de aproximadamente 7450 años de edad.

Una forma extrema de interrupción de los procesos de descomposición –y por lo tanto de fijación natural–, es la que ocurre en aquellos organismos que han quedado atrapados –o encriptados– en ciertas resinas de árboles del grupo de las coníferas que, al fosilizarse, producen una de las pocas gemas orgánicas conocidas, el ámbar. Existen numerosos ejemplos de insectos, plantas y aun vertebrados, de decenas de millones de años de antigüedad, incluidos en ámbar, en buen estado de preservación morfológica, y cuyo ADN se ha podido recuperar

Finalmente, las temperaturas muy bajas –y persistentes– son un factor de preservación inigualable del material orgánico. Así lo demuestran los estudios realizados en el ‘hombre de hielo’ encontrado en los Alpes tiroleses después de 5000 años, y los mamuts de Siberia, hallados en excelente estado de preservación luego de 20.000 a 40.000 años. En ambos casos fue posible extraer y analizar el ADN en forma exitosa. 

El estudio del ADN 

En las especies vivas solo basta con tomar una pequeña muestra de células –sean estas provenientes de la sangre, la piel, los músculos, etc.– , y conservarlas en un medio conveniente hasta el momento de su análisis. Generalmente, las muestras de material fresco –o el organismo entero, en caso de ser pequeño–, se colocan en un lugar refrigerado en frascos conteniendo alcohol absoluto, o directamente en un freezer de -70°C o -80°C.

El procedimiento de recuperación del ADN de especimenes arcaicos no dependerá de la especie en estudio, sino del tipo de proceso que permitió la preservación del tejido. Por ejemplo, si se desea estudiar el ADN de huesos, los mejores resultados se obtienen en aquellos que provienen de excavaciones recientes. Si se trata de material depositado en colecciones de museos, se deberán elegir los huesos más compactos y no usar las superficies externas, ya que estas pueden estar contaminadas con el ADN de otros organismos. El hueso debe ser lavado y mantenido en condiciones de baja humedad. Una vez realizados estos procedimientos, los huesos, o los tejidos secos o momificados a estudiar, se inspeccionan cuidadosamente con el microscopio óptico a los efectos de hallar núcleos celulares donde pueda haber ADN.

El ADN de plantas fosilizadas en el interior de rocas debe ser extraído directamente en el sitio, ya que es conveniente evitar que la materia orgánica quede expuesta a la desecación, el oxígeno, la luz solar, u otros factores externos que puedan alterarla.

La metodología de estudio del ADN antiguo es similar a la utilizada con el material fresco. Primero se aplica la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que permite amplificar el material, o sea preparar numerosas copias de un determinado fragmento de ADN. Es decir que aunque la cantidad inicial de ADN sea muy escasa, luego de la reacción de PCR se dispondrá de material suficiente como para proceder a su secuenciación, o sea la determinación del orden en que se encuentran ubicadas las bases nitrogenadas, responsables de la información genética que reside en el ADN. La secuenciación se realiza de forma automática, en varias etapas. Un método consiste en volver a amplificar el ADN por medio de una reacción de PCR especial, la cual permite la obtención de fragmentos fluorescentes, de distintos tamaños, los que son luego separados por electroforesis –los fragmentos migran en un gel al que se aplica un campo eléctrico; la velocidad de migración dependerá del tamaño del fragmento–. Durante este proceso un lector láser detecta la emisión fluorescente de cada fragmento la cual, a su vez, depende de la última base nitrogenada que se incorporó en cada uno de ellos en la reacción de PCR; es decir que de acuerdo con la fluorescencia emitida se identifica la base. Finalmente, esta información es transmitida a una computadora que transforma los datos obtenidos en la secuencia del fragmento.

Las secuencias de ADN de distintos individuos pertenecientes a la misma o diferentes especies se comparan mediante programas de computación que permiten detectar sitios de secuencias homólogas o equivalentes, lo cual permite elaborar los árboles filogenéticos o cladogramas. Estos diagramas expresan las relaciones de parentesco entre las unidades evolutivas analizadas.

Principales dificultades 

Recordemos que en el ADN las bases nitrogenadas están enfrentadas –apareadas–, por lo que la longitud de una molécula se expresa como número de pares de bases (pb). Cuando se estudia material fresco se logra amplificar fragmentos de miles de pb de largo. En cambio, en tejidos antiguos los fragmentos por lo general no exceden los 200pb, debido a la degradación del ADN que ocurre después de la muerte del organismo. El estudio de este ADN resulta entonces mucho más laborioso que el del fresco, ya que se deben amplificar numerosos fragmentos de corta longitud que abarquen, en lo posible, porciones de ADN superpuestas. De este modo, se obtienen secuencias de corta longitud que constituyen algo así como las piezas de un rompecabezas. Estas secuencias se superponen unas con otras analizando sus extremos coincidentes, de manera tal de recomponer una secuencia de ADN más larga. 

En el ADN antiguo suelen ocurrir daños que se van acumulando con el transcurso del tiempo. Ciertas reacciones de oxidación causan modificaciones en las bases nitrogenadas o pérdidas de las mismas, que provocan enlaces anómalos y roturas en la cadena de ADN. En consecuencia la molécula de ADN se degrada, alterándose la información genética. Por ejemplo, las bases nitrogenadas denominadas pirimidinas –como la citosina y la timina– se oxidan con facilidad, por lo que en material arqueológico se observan abundantes pirimidinas modificadas. Las purinas –adenina y guanina– también se oxidan, y así se produce 8-hidroxiguanina, de tal forma que en la reacción de PCR no se reconocerán correctamente dichas bases modificadas y se interrumpirá la reacción. 

La mayor dificultad que enfrenta el investigador que analiza el ADN antiguo es la posible contaminación de la muestra problema con el ADN de hongos, bacterias, parásitos e inclusive de células de la piel de los investigadores o curadores que hayan manipulado el material, o de restos de ADN de otros experimentos realizados en el mismo laboratorio. Para evitar este problema se deben llevar a cabo procedimientos estrictos con respecto a la selección y preparación del material de estudio, la elección de los ‘cebadores’ a utilizar en la técnica de PCR, y las condiciones de esterilidad del laboratorio donde se realizará el análisis.

De acuerdo con el investigador norteamericano Jeremy Austin, los requerimientos esenciales para demostrar la autenticidad del ADN antiguo son los siguientes:

Seleccionar ejemplares y muestras de estudio en los que se observe una buena preservación de las células y sus biomoléculas. 

Seguir procedimientos de laboratorio estrictos que minimicen la contaminación. 

Reproducir el experimento, es decir, obtener el ADN supuestamente antiguo, a partir de distintas extracciones y distintos tejidos de un mismo ejemplar, de diferentes especimenes, y en última instancia, en laboratorios independientes. 

Realizar la comparación –u homologación– de la secuencia obtenida con el universo de secuencias conocidas disponibles en las bases de datos –por ejemplo el GeneBank– mediante procedimientos informáticos adecuados. Estas secuencias deberán ser analizadas en un contexto filogenético, es decir, juntamente con secuencias de otras especies, vivientes o extinguidas, del mismo grupo taxonómico.

Los pioneros en la búsqueda del ADN antiguo 

A principios de la década del ochenta, los biólogos ya tenían conocimiento de que en tejidos muertos –pieles de animales, huesos y cuerpos momificados–, podían encontrarse macromoléculas proteicas e incluso ADN bien preservado. Sin embargo, las técnicas utilizadas para extraer dichas moléculas y para secuenciar el ADN no habían sido exitosas. 

El primer trabajo donde se demostró que era posible secuenciar ADN antiguo fue publicado en 1984 por los investigadores norteamericanos Russell Higuchi y Allan Wilson, de la Universidad de California, Berkeley. Ellos extrajeron ADN de músculo seco y piel de un ejemplar de cuagga (Equus quagga), especie de équido que vivió en África del Sur y se extinguió hace aproximadamente 140 años. El material estudiado estaba guardado en el Museo de Historia Natural de Mainz, Alemania, y pertenecía a un animal –el último sobreviviente de la especie– muerto en el zoológico de Amsterdam en 1883. Los investigadores de Berkeley lograron extraer ADN de sus tejidos, en una proporción 100 veces menor que la que se podía obtener a partir de tejidos vivos y secuenciaron un segmento corto, de 115 pares de bases. Al comparar esta secuencia con otra perteneciente a una cebra, descubrieron que presentaban muy pocas diferencias, demostrando así la estrecha relación filogenética entre ambas especies. En su trabajo de 1984, publicado en Nature, Higuchi y Wilson anticiparon que la confirmación de que el ADN podía sobrevivir por largos períodos de tiempo, tendría un gran impacto en la paleontología, la biología evolutiva, la arqueología y la medicina forense, beneficiando el desarrollo de estas disciplinas. 

Un año después de la publicación mencionada, Svante Pääbo, de la Universidad de Munich, logró extraer ADN a partir de células de la piel de momias egipcias de más de 2000 años de antigüedad. En investigaciones previas, realizadas en la Universidad de Uppsala, el especialista ya había comprobado que era posible extraer ADN a partir de tejidos momificados. Para realizar el trabajo publicado en 1985, S. Pääbo revisó 110 momias depositadas en el Museo de la Universidad de Uppsala y en el Museo Estatal de Berlín, entre las cuales seleccionó las 23 que se hallaban mejor conservadas. Solo pudo extraer ADN de dos momias, en una proporción de 20 microgramos por gramo de tejido seco. De este modo Pääbo se convirtió en el pionero de los estudios de ADN en humanos.

Gracias al advenimiento de la técnica de PCR, en 1986, se produjo un espectacular avance en el estudio de muestras arqueológicas. Otros grupos de especialistas, además de aquellos liderados por Pääbo, analizaron material momificado de hasta 7500 años de edad, de donde se obtuvo información sobre un tipo particular de secuencias de ADN repetidas –o microsatélites–, secuencias de genes de histocompatibilidad y principalmente de genes mitocondriales. Posteriormente S. Pääbo se asoció con otros grupos de investigadores, produciendo trabajos pioneros que sirvieron de modelo para los estudios de ADN antiguo en diversas especies de animales y plantas. 

A mediados de la década del noventa se habían secuenciado fragmentos de ADN de varias especies extinguidas de vertebrados, entre ellos el lobo marsupial o tilacino, de una antigüedad de 120 años; el tigre diente de sable o Smilodon, de 14.000 años; el mamut lanudo de Siberia, de 40.000 años; y las moas de Nueva Zelanda, de aproximadamente 3300 años. Además, se extrajo ADN de la hoja de una magnolia de 17 millones de años (Ma) y de varias especies de insectos fósiles preservados en ámbar. Entre estas últimas merecen ser citadas la abeja sin aguijón Proplebeia dominicana y la termite Mastotermes electrodominicus del ámbar de la República Dominicana de 45-25 millones de años, así como el gorgojo Libanorhinus succinus del ámbar del Líbano, datado en 135-120 millones de años.

Ejemplos interesantes 

Las moas de Nueva Zelanda constituyen un grupo de aves no voladoras de hasta tres metros de altura y 200kg de peso; que en el pasado habría sido bastante diverso, pero actualmente está extinguido a causa del hombre. Las moas pertenecen al taxón denominado ratites, en el cual se incluyen también los avestruces de África, los ñandúes de América del Sur, el casuario y el emú de Australia y Nueva Guinea, y las especies vivientes de kiwi, también de Nueva Zelanda. La interpretación histórica de la distribución de las ratites sugiere que su presencia en los continentes del sur se debe a que su especie ancestral habitaba el primitivo supercontinente Gondwana, que al dividirse dio origen a América del Sur, África, Oceanía y Antártida.

Tomando en cuenta caracteres morfológicos y biogeográficos, se interpretaba que las moas eran el grupo ‘hermano’ –genealógicamente más próximo– de los kiwis de Nueva Zelanda. Sin embargo, esta hipótesis cambió cuando el biólogo neozelandés Alan Cooper y otros investigadores que trabajaron junto a él en la Universidad de California, Berkeley, pudieron obtener ADN antiguo de cuatro de las doce especies de moas descriptas por los paleontólogos. Estos investigadores amplificaron fragmentos de ADN de hasta 400 pares de bases a partir de material momificado –huesos y tejido blando seco–, hallado en cuevas, de una antigüedad de aproximadamente 4000 años. La mayor parte del material estudiado se hallaba preservado en la Colección Nacional de Tejidos Congelados, del Museo Nacional de Nueva Zelanda, en Wellington. Cuando se practicó el análisis cladístico de las secuencias obtenidas, resultó que las moas no eran ‘hermanas’ de los kiwis, sino que habían surgido primero en la historia de las ratites, siguiendo en orden filogenético los avestruces, el grupo casuario-emú, y los kiwis. Este cladograma sugiere que las moas habitaron Nueva Zelanda antes que los kiwis, y que estos habrían arribado posteriormente, diferenciándose a partir de un antecesor común del grupo casuario-emú de Australia y Nueva Guinea. Estudios recientes sobre plantas y otros grupos de aves parecen confirmar la hipótesis de que numerosos taxones que hoy habitan en Nueva Zelanda, habrían llegado desde Australia hace unos 40-50 millones de años, cuando ambas islas estaban conectadas por el puente de Nueva Caledonia.

Otro interesante estudio donde la hipótesis filogenética clásica se vio dramáticamente alterada cuando se incorporaron datos del ADN antiguo se refiere a la relación entre las termites (Isoptera) y sus grupos taxonómicos más próximos, representados por las cucarachas y mántidos (Dictyoptera) y las langostas y tucuras (Orthoptera). De acuerdo con la visión tradicional, la familia Mastotermitidae, cuya única especie viviente es Mastotermes darwiniensis, presenta caracteres primitivos, que permiten considerarla como un eslabón evolutivo entre el resto de las termites y las cucarachas. El especialista Rob DeSalle y sus colegas del Museo Americano de Nueva York, fueron capaces de amplificar y secuenciar fragmentos de genes de la especie extinguida Mastotermes electrodominicus, a partir de material conservado en ámbar de aproximadamente 30-25Ma. Los resultados del análisis filogenético molecular, indican que Mastotermes es un género monofilético –M. darwiniensis y M. electrodominicus aparecen como especies ‘hermanas’ en el cladograma–, y que las termites constituyen un grupo natural con un antecesor común más próximo, cuya relación con las cucarachas es más lejana.

El debate sobre la autenticidad del ADN antiguo 

A partir de los impresionantes adelantos ocurridos en la obtención de ADN antiguo se ha generado una gran expectativa, pero también se han suscitado debates sobre la autenticidad de algunos resultados, sobre todo cuando ciertos experimentos no se pudieron reproducir en laboratorios independientes de aquellos que reclamaban un cierto hallazgo. 

De acuerdo con el especialista inglés Thomas Lindahl, los cálculos teóricos referentes a la estructura química del ADN sugieren que esta molécula no podría sobrevivir más de 100.000 años y aun de manera muy fragmentada, lo cual desacreditaría los trabajos que analizan ADN antiguo de muestras de millones de años de antigüedad. Para probar esta hipótesis, Lindahl midió el coeficiente de racemización en tejidos de los cuales se había extraído ADN antiguo, incluyendo un hueso del dinosaurio Tirannosaurus rex de 65Ma, hojas de una magnolia y de otra planta del género Taxodium de 20-17Ma, y de varios insectos preservados en ámbar. Puesto que la proporción del isómero D del ácido aspártico –indicador del porcentaje de ADN remanente en buen estado de preservación en tejidos muertos– excedía ampliamente el límite considerado adecuado, se concluyó que, excepto en las muestras preservadas en ámbar, el ADN no sería auténticamente antiguo. En este último caso, los niveles de racemización eran comparables a los de muestras arqueológicas de menor antigüedad (pocos miles de años), por lo que se interpretó que el ambiente químico de dicha gema orgánica brindaría condiciones de preservación excepcionales, que bloquearían la degradación bacteriana del ADN. Es decir que el ADN antiguo de fósiles preservados en ámbar podría superar los 100.000 años de ‘vida’. 

Un caso controvertido es el del gorgojo Libanorhinus succinus del ámbar del Líbano, el cual representa el material más antiguo conocido hasta el presente (135-120Ma) del cual se ha podido extraer ADN. Los estudios sobre dicha especie fueron realizados originalmente por el biólogo molecular norteamericano Raúl Cano y sus colaboradores de la Universidad Politécnica del Estado de California, Estados Unidos. En su publicación de 1993, los autores analizaron la secuencia obtenida en un contexto filogenético, es decir comparándola con secuencias de ADN de otros insectos, concluyendo que se aproxima a la de otro gorgojo de la misma familia. Sin embargo, estos resultados se han puesto en duda, puesto que los experimentos originales no se pudieron reproducir en distintos laboratorios. 

El futuro 

En los últimos años la Paleontología Molecular ha tenido una gran expansión, desbordando a veces la imaginación de especialistas y legos, y generando grandes expectativas. Sin embargo, esta disciplina todavía está en una etapa de desarrollo, de manera que muchos de los resultados obtenidos, sobre todo los provenientes de muestras que superan los millones de años, suelen incluir un considerable margen de error. 

La información proveniente de la Arqueología Molecular, en cambio, es más confiable que la mayoría de los datos paleontológicos, dado que su antigüedad no supera los miles de años; ejemplo de esto son las secuencias de ADN antiguo obtenidas a partir de momias egipcias preservadas por medios artificiales, o de momias de los aborígenes sudamericanos, naturalmente conservadas en ambientes secos. Entre los materiales arqueológicos no solo se consideran los restos humanos, sino además todo el material biológico asociado a los mismos, como los animales y vegetales que empleaban para su alimentación. El estudio del ADN de semillas antiguas, por ejemplo, puede proveer información relevante sobre los ancestros de plantas actualmente domesticadas y sobre la relación entre dicha domesticación y los distintos grupos aborígenes.

Un grupo de investigadores pertenecientes al Laboratorio de Genética Evolutiva del Departamento de Ciencias Biológicas (Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBA) y al Centro de Investigaciones Genéticas (CONICET, CIC, UNLP) está realizando estudios de ADN antiguo proveniente de cariopses –granos de mazorca– de Zea mays, de aproximadamente 2000 años de antigüedad, pertenecientes a un conjunto de razas nativas que fueron encontradas junto a una momia en el noroeste argentino. Se espera obtener evidencias de las modificaciones genéticas ocurridas durante el proceso de domesticación del maíz, y realizar así un aporte sustancial a los estudios arqueológicos sobre los aborígenes sudamericanos.

Como hemos descripto, los datos provenientes de las secuencias del ADN antiguo han permitido plantear nuevas hipótesis sobre las relaciones de parentesco, el origen y la distribución de numerosos grupos de organismos, pertenecientes tanto a especies extinguidas como actuales. Este tipo de estudios ha causado un gran impacto en disciplinas biológicas relacionadas con la clasificación, la evolución y la biogeografía. En el futuro próximo, la incorporación de datos obtenidos por técnicas de biología molecular a partir de especies extinguidas en estudios sistemáticos y filogenéticos, será cada vez más frecuente. Sin embargo, la importancia y confiabilidad de los resultados dependerá en gran medida de la autenticidad del ADN antiguo. Por eso resulta tan importante conservar adecuadamente el material depositado en los museos, y actualizar los procedimientos y metodologías para la preservación y mantenimiento de las colecciones. 

La información sobre el ADN de especies o poblaciones recientemente extinguidas o en peligro de extinción, permitirá además adoptar medidas en favor de la conservación de la biodiversidad. Por ejemplo, comparando la variabilidad genética de poblaciones extinguidas, representadas por individuos preservados en colecciones de museos, con la variabilidad de poblaciones naturales de la misma especie, se podrían plantear hipótesis sobre las causas de la extinción poblacional. Entre los indicadores de la declinación de las especies producida por el deterioro ambiental provocado por las actividades humanas se encuentran la disminución de la variabilidad genética y la disminución del valor adaptativo producida por la endocría y la fijación de nuevas mutaciones deletéreas. Si mediante estudios de ADN se pudiera detectar esa disminución y otros indicadores de declinación poblacional, se brindarían importantes elementos para tomar medidas en favor de las especies en retracción numérica o en riesgo de extinción.

Las técnicas que permiten extraer y analizar el ADN antiguo, contribuyen a profundizar nuestros conocimientos sobre organismos extinguidos en tiempos prehistóricos por causas naturales, y en tiempos históricos a causa de la acción devastadora del hombre; se han transformado en herramientas fundamentales para plantear nuevas hipótesis en varias ramas de la Biología, entre ellas: Paleontología, Sistemática filogenética, Ecología de poblaciones, Biogeografía histórica y Conservación de la biodiversidad. Los estudios del ADN antiguo han dado un renovado impulso a las investigaciones antropológicas y arqueológicas relacionadas con la evolución de poblaciones humanas y sus hábitos culturales. Es de esperar que el avance tecnológico en el campo de la biología molecular ayude a obtener resultados cada vez más confiables.

El ámbar y la genética del ADN